质粒线性化用酶的选择都有哪些讲究？

随着国内防疫政策的不断优化，加强疫苗接种率成为重中之重。仅一周之内，多款新冠疫苗被纳入紧急使用。日前，沃森生物也在互动平台表示，其新冠mRNA疫苗的国内III期临床试验数据整理及统计分析工作已进入尾声，并已向CDE提交海外III期临床研究首次分析报告，不断推动国内上市进程。

(资料图片)

mRNA的制备过程中，在选择质粒线性化工具时，IIS型限制性内切酶成为mRNA模板制备的首选，原因是其酶切位点在识别位点以外，酶切后可将Poly A结构直接暴露在3’端而不产生冗余的酶切位点残基，从根本上杜绝多余碱基造成的不确定性。BspQI和BsaI作为一种IIS型限制性内切酶，被广泛应用于mRNA模板制备，其酶切识别位点分别长达7个和6个碱基，具有高度特异性，极不容易在目标序列中出现相同酶切位点，能够有效避免出现非特异性的酶切。

5’...GCTCTTC(N)1↓...3’

3’...CGAGAAG(N)4↑...5’

图一BspQI酶切识别位点

5’...GGTCTC(N)1↓...3’

3’...CCAGAG(N)5↑...5’

图二BsaI酶切识别位点

此外，在质粒线性化过程中，还要求酶切产物必须为5’端突出末端，因为如果酶切产生3’突出末端的模板，在体外转录（IVT）时，就会增加副产物dsRNA的生成风险，而dsRNA是一类免疫反应的强刺激物，需要严格控制，才能保证mRNA疫苗的有效性。质粒线性化中，除了上述两种酶，XbaI因其可产生5‘端突出序列也常被应用于生产中。

5’...T↓CTAGA...3’

3’...AGATC↑T...5’

图三XbaI酶切识别位点

近岸蛋白在推动mRNA疫苗研发生产过程中不断探索创新，于近期又新增两款GMP级限制性内切酶BspQI和XbaI，为客户提供更多的酶切位点选择。

产品特点

酶切活性高

图四M为Marker；1为阴性；2为常规反应体系酶切结果；3为反应体系内buffer调整用量至4μl；4为反应体系内BspQI酶调整用量至0.8μl ；5为反应体系内调整质粒用量至1.5μg。结果无明显差异，证明酶活性高，可适应反应体系内各组分调整。

图五M为Marker；1为500ng底物；2为1μg底物；3为5μg底物；4为7.5μg底物；5为10μg底物；6为15μg底物；7为30μg底物；8为45μg底物；常规反应体系内，近岸蛋白XbaI可以完全酶切15μg底物，证明酶活性高，反应底物可根据具体切割质粒类型灵活调整。

Buffer兼容性好

图六M为Marker；1为阴性；2为近岸蛋白BspQI及对应反应Buffer体系；3为N品牌BspQI及对应反应Buffer体系；4为近岸蛋白BspQI与Buffer1反应体系；5为近岸蛋白BspQI与Buffer2反应体系；6为近岸蛋白BspQI与Buffer3反应体系；7为近岸蛋白BspQI与Buffer4反应体系。结果无明显差异，证明近岸蛋白BspQI适配市面上常见酶切反应Buffer，兼容性好。

热稳定性好

图七左图为37℃放置0天，右图为37℃放置7天；泳道1为1ul酶用量，泳道2-6为2倍酶活梯度稀释，泳道7为阴性，结果显示BspQI酶活无明显变化，证明其热稳定性强。

图八左图为37℃放置0天，右图为37℃放置7天；泳道1为1ul酶用量，泳道2-6为2倍酶活梯度稀释，结果显示XbaI酶活无明显变化，证明其热稳定性强。

过夜酶切及甘油浓度变化，无星号活性

图九M为Marker；1为阴性；2为N品牌10U BspQI；3为近岸蛋白10U BspQI；4为近岸蛋白20U BspQI；5为近岸蛋白40U BspQI；以lamda-HindIII DNA为底物（底物中含有两个BspQI酶切位点），过夜酶切（16h），结果显示近岸蛋白BspQI星号活性极低。

图十M为Marker；1为甘油浓度1%，反应1小时；2为甘油浓度1%，反应16小时；3为甘油浓度5%反应16小时；4为甘油浓度10%，反应16小时。结果显示近岸蛋白XbaI无星号活性。

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关键词： 识别位点 酶切位点 热稳定性